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Nature volume 617, páginas 711–716 (2023) Citar este artigo

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A microscopia de fluorescência, com sua especificidade molecular, é um dos principais métodos de caracterização utilizados nas ciências da vida para entender sistemas biológicos complexos. Abordagens de super-resolução1,2,3,4,5,6 podem atingir resolução em células na faixa de 15 a 20 nm, mas interações entre biomoléculas individuais ocorrem em escalas de comprimento abaixo de 10 nm e a caracterização da estrutura intramolecular requer resolução de Ångström. Implementações de super-resolução de última geração7,8,9,10,11,12,13,14 demonstraram resoluções espaciais de até 5 nm e precisões de localização de 1 nm sob certas condições in vitro. No entanto, tais resoluções não se traduzem diretamente em experimentos em células, e a resolução de Ångström não foi demonstrada até o momento. Aqui, introduzimos um método de código de barras de DNA, aprimoramento de resolução por imagem sequencial (RESI), que melhora a resolução da microscopia de fluorescência até a escala Ångström usando reagentes e hardware de microscopia de fluorescência disponíveis no mercado. Ao gerar imagens sequencialmente de subconjuntos de alvos esparsos em resoluções espaciais moderadas de > 15 nm, demonstramos que a resolução de proteína única pode ser alcançada para biomoléculas em células inteiras intactas. Além disso, resolvemos experimentalmente a distância do backbone de DNA de bases únicas em origami de DNA com resolução de Ångström. Usamos nosso método em uma demonstração de prova de princípio para mapear o arranjo molecular do alvo de imunoterapia CD20 in situ em células não tratadas e tratadas com drogas, o que abre possibilidades para avaliar os mecanismos moleculares da imunoterapia direcionada. Essas observações demonstram que, ao permitir imagens intramoleculares sob condições ambientais em células inteiras intactas, o RESI fecha a lacuna entre a microscopia de super-resolução e os estudos de biologia estrutural e, assim, fornece informações importantes para a compreensão de sistemas biológicos complexos.

A precisão de localização (σSMLM) de uma molécula alvo na microscopia de localização de molécula única de campo amplo (SMLM)15 é fundamentalmente limitada pelo número de fótons (N) coletados por evento piscante: \({\sigma }_{{\rm {SMLM}}}\approx \frac{{\sigma }_{{\rm{DIFF}}}}{\sqrt{N}}\) (σDIFF é o sd da função de dispersão de pontos (PSF) da óptica sistema de imagem16; Fig. 1a). Múltiplas localizações do mesmo alvo (Fig. 1b, topo) são distribuídas em torno da posição real devido à sua precisão finita. Dois ou mais pontos que não podem ser resolvidos por SMLM produzem distribuições sobrepostas de localizações, impedindo assim a atribuição única de localizações aos respectivos alvos (Fig. 1b, abaixo). No entanto, se cada localização pudesse ser atribuída a um alvo específico por cor, código de barras ou qualquer outra identidade molecular, eles poderiam ser agrupados inequivocamente por alvo2.

a, Em SMLM, σSMLM de uma única escala de corante com \(\frac{{\sigma }_{{\rm{DIFF}}}}{\sqrt{N}}\), limitando a resolução espacial alcançável. b, abordagens SMLM, como DNA-PAINT, apresentam resolução espacial de aproximadamente 10 nm (resolução aproximada como largura total na metade do máximo ≈ 2,35 σSMLM). Enquanto alvos separados por 20 nm (d1) podem ser resolvidos rotineiramente, objetos separados por 2 nm (d2) não podem ser resolvidos porque as distribuições resultantes de localizações se sobrepõem. c, Usando sequências ortogonais de DNA (azul e verde) e aquisição sequencial como no Exchange-PAINT, as localizações de alvos espaçados mais de perto do que o limite de resolução SMLM podem ser atribuídas de forma inequívoca para cada alvo. d, A combinação de todas as localizações por alvo (K) para cada rodada de imagem melhora a precisão da localização de sd (σSMLM) para sem (σRESI). e, Como a super-resolução revolucionou a microscopia de fluorescência, o RESI resulta em outra mudança de paradigma ao reaplicar o conceito de localização aos dados de super-resolução. f, Precisão de localização em escalas RESI com \(\frac{1}{\sqrt{K}}\), e assim a melhoria da resolução em RESI é independente de σSMLM, alcançando precisão de localização na escala de Ångström.