Vendo a vida sem rótulos sob microscópios ópticos

Biologia das Comunicações volume 6, Número do artigo: 559 (2023) Cite este artigo

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Os microscópios ópticos hoje ultrapassaram os limites de velocidade, qualidade e espaço observável em espécimes biológicos, revolucionando a forma como vemos a vida hoje. Além disso, a rotulagem específica de amostras para geração de imagens forneceu informações sobre como a vida funciona. Isso permitiu que a microscopia baseada em rótulos se infiltrasse e se integrasse à pesquisa de ciências da vida convencional. No entanto, o uso de microscopia sem rótulo tem sido limitado, resultando em testes para bioaplicação, mas não para biointegração. Para permitir a biointegração, tais microscópios precisam ser avaliados quanto à sua pontualidade para responder a questões biológicas de forma única e estabelecer uma perspectiva de crescimento a longo prazo. O artigo apresenta os principais microscópios ópticos sem rótulo e discute seu potencial integrador na pesquisa de ciências da vida para a análise imperturbável de amostras biológicas.

Historicamente, a microscopia óptica avançou paralelamente às ciências da vida. Hoje, qualquer instalação de pesquisa biológica padrão é equipada com um microscópio para morfologias de imagem no modo de campo claro e distribuições moleculares no modo de epifluorescência para observar estruturas de interesse marcadas. Essa configuração é o ponto ideal para biólogos, pois a maioria dos estudos pode ser realizada com esse sistema ou projetada para ser acomodada neles. A necessidade de quantificação molecular e seccionamento óptico preciso fez da microscopia confocal de varredura a laser a favorita entre os biólogos. O crescente interesse em imagens rápidas e ao vivo de amostras espessas em 3D serviu como feedback oportuno para desenvolver ferramentas de imagem como multifótons1,2,3,4,5,6 e microscópios de folha de luz7,8,9. A necessidade de observar mudanças dinâmicas celulares encorajou métodos baseados em fluorescência, como transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET)10, 11, microscopia de imagens de vida útil de fluorescência (FLIM)12,13 e recuperação de fluorescência após fotobranqueamento (FRAP)14,15. A importância de observar detalhes minuciosos motivou métodos de super-resolução como iluminação estruturada (SIM)16,17, depleção de emissão estimulada (STED)18,19 e microscopia de localização de molécula única (SMLM)20,21,22. Sistemas de suporte como câmeras mais rápidas, automação adaptativa de alto rendimento e corantes inovadores ampliaram ainda mais as aplicações biológicas. Ainda assim, existe uma lacuna onde os métodos baseados em rótulos são limitados, ou seja, na avaliação quimicamente imperturbável de amostras biológicas, sem qualquer intervenção de rótulos e produtos químicos associados.

Muitos métodos de imagem labelfree bem conhecidos, apesar de suas vantagens, são limitados quando o objetivo é estudos mecanísticos ou descoberta de conhecimento. Por exemplo, microscopia de campo claro, contraste de fase e contraste de interferência diferencial (DIC) são escolhas comuns dos biólogos. A microscopia de campo claro é mais adequada quando as amostras são coradas com um corante que confere o contraste. No entanto, para estudos ao vivo, obter imagens de alto contraste para células vivas quase transparentes é um desafio. O contraste de fase e a geração de imagens DIC aumentam opticamente a diferença entre a amostra e o fundo para gerar uma imagem de alto contraste e são usados ​​rotineiramente com a microscopia de fluorescência. Tanto o contraste de fase quanto a imagem DIC são ferramentas muito úteis para um biólogo. Mas eles não podem quantificar as mudanças de fase, pois os valores de intensidade não estão linearmente relacionados à informação de fase e, portanto, não podem ser rastreados até as mudanças reais na amostra.

Hoje, o avanço na geração de imagens sem marcadores permitiu imagens de alta resolução e alta velocidade de morfologia, dinâmica, funcionalidade, troca de materiais, interação com patógenos, bioquímica e biomecânica (Fig. 1). Este artigo discute a ampla seleção de diferentes microscópios ópticos labelfree, suas aplicações biológicas e seu potencial para se transformar em uma poderosa ferramenta de pesquisa biomédica convencional. Este artigo, portanto, visa estabelecer bases para a escolha de ferramentas adequadas de microscopia óptica sem rótulo para aumentar os métodos estabelecidos e, eventualmente, desempenhar um papel mais integrador na descoberta de conhecimento.