Um conjunto de vetores e cepas para integração cromossômica em levedura de fissão

Scientific Reports volume 13, Número do artigo: 9295 (2023) Cite este artigo

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A expressão de genes heterólogos é uma técnica importante na genética de leveduras. Na levedura de fissão, os genes leu1 e ura4 têm sido usados ​​principalmente como marcadores selecionáveis ​​para expressão heteróloga. Para expandir o repertório de marcadores de seleção disponíveis para expressão heteróloga de genes, aqui desenvolvemos novos sistemas hospedeiro-vetor empregando lys1 e arg3. Ao empregar a edição do genoma com o sistema CRISPR/Cas9, isolamos vários alelos de lys1 e arg3, cada um com uma mutação crítica na região ORF. Paralelamente, desenvolvemos um conjunto de vetores que complementam a auxotrofia de aminoácidos dos mutantes lys1 e arg3 quando integrados em cada locus. Usando esses vetores em combinação com o vetor de integração pDUAL desenvolvido anteriormente, observamos com sucesso a localização de três proteínas em uma célula simultaneamente, fundindo-as com diferentes proteínas fluorescentes. Assim, esses vetores permitem a expressão combinatória de genes heterólogos, que abordam desafios experimentais cada vez mais diversos.

O estudo da biologia de leveduras estimulou o desenvolvimento de sistemas experimentais sofisticados para elucidar os mecanismos moleculares subjacentes a uma variedade de fenômenos biológicos. Recentemente, para explorar esses mecanismos moleculares mais profundamente, às vezes são necessários sistemas experimentais complicados. Em muitos casos, um experimento tão complicado requer a expressão de vários transgenes em uma célula. Para isso, vários vetores, que podem ser usados ​​como plasmídeos epissomais ou vetores integrativos, e promotores constitutivos ou induzíveis, foram desenvolvidos1, 2. Os sistemas de expressão que podem reproduzir condições semelhantes a ambientes fisiológicos são preferidos. Nesse sentido, o uso de vetores integrativos é um dos sistemas de ponta utilizados na biologia de leveduras em vez de vetores epissomais3.

Desenvolvemos anteriormente dois tipos de vetores epissomais que também podem ser usados ​​para integração cromossômica por recombinação de cruzamento único4, 5. Um tipo de vetor é projetado para ser integrado nos loci lys1, arg1 ou his3. Quando esses vetores são integrados com sucesso nos loci alvo, os transformantes tornam-se auxotróficos para os aminoácidos correspondentes. O mérito desses vetores é que eles podem ser usados ​​para cepas sem auxotrofia de aminoácidos. Portanto, em muitos casos, esses vetores podem ser usados ​​sem preparar uma nova cepa hospedeira. No entanto, o fato de a integração dos vetores no genoma resultar em auxotrofia de aminoácidos é uma desvantagem em alguns casos. Por outro lado, os vetores da série pDUAL são projetados para integração no leu1 locus4. Embora possam ser usados ​​apenas para cepas com o alelo leu1-32, os transformantes tornam-se prototróficos para leucina, permitindo fácil seleção dos transformantes (Fig. 1). O fato de os vetores pDUAL não conterem uma cópia funcional do gene leu1 evita a seleção de transformantes nos quais os plasmídeos são integrados aleatoriamente no genoma. Embora ambos os tipos de vetores tenham suas próprias vantagens e desvantagens, os vetores do tipo pDUAL parecem mais úteis do ponto de vista da seleção e manutenção de transformantes adequados.

Integração de pDUAL no genoma do mutante leu1-32. Os vetores da série pDUAL têm uma parte do gene leu1 contendo sítios de reconhecimento de enzimas de restrição dentro da região leu1 ORF. Quando a recombinação cruzada simples ocorre a jusante do ponto de mutação do alelo leu1-32, espera-se que o genoma resultante tenha duas cópias de leu1, uma sem a parte 3' e a outra sendo um gene funcional completo. O esquema não está em escala.

Neste artigo, levando em consideração a estratégia de recombinação de cruzamento único do tipo pDUAL, tentamos desenvolver novos sistemas hospedeiro-vetor visando loci diferentes de leu1. Usando o sistema CRISPR/Cas9 recentemente desenvolvido em levedura de fissão6, isolamos com sucesso cepas com mutações críticas de frameshift em lys1 ou arg37, 8. Também construímos vetores que poderiam complementar a auxotrofia de aminoácidos desses mutantes após a integração direcionada ao cromossomo. Juntamente com os vetores pDUAL desenvolvidos anteriormente, a expressão de três transgenes em transformantes prototróficos está agora disponível sem o uso de marcadores resistentes a drogas.