A criopreservação de ilhotas pancreáticas por vitrificação alcança alta viabilidade, função, recuperação e escalabilidade clínica para transplante

Nature Medicine volume 28, páginas 798–808 (2022) Citar este artigo

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O transplante de ilhotas pancreáticas pode curar o diabetes, mas requer ilhotas acessíveis e de alta qualidade em quantidades suficientes. A criopreservação pode resolver os desafios da cadeia de suprimentos de ilhotas, permitindo bancos com controle de qualidade e agrupamento de ilhotas doadoras. Infelizmente, a criopreservação não conseguiu atingir esse objetivo, pois deve fornecer simultaneamente alta recuperação, viabilidade, função e escalabilidade. Aqui, alcançamos esse objetivo em ilhotas de células-tronco (SC-beta) derivadas de células-tronco humanas (SC) de camundongos, suínos e humanos por meio da otimização abrangente da composição do agente crioprotetor (CPA), condições de carregamento e descarregamento de CPA e métodos para vitrificação e reaquecimento (VR). A viabilidade das ilhotas pós-VR, em relação ao controle, foi de 90,5% para camundongos, 92,1% para SC-beta, 87,2% para suínos e 87,4% para ilhotas humanas, e permaneceu inalterada por pelo menos 9 meses de armazenamento criogênico. As ilhotas VR tinham morfologia macroscópica, microscópica e ultraestrutural normais. O potencial de membrana mitocondrial e os níveis de trifosfato de adenosina (ATP) foram ligeiramente reduzidos, mas todas as outras medidas da respiração celular, incluindo a taxa de consumo de oxigênio (OCR) para produzir ATP, permaneceram inalteradas. As ilhotas VR tinham função normal de secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS) in vitro e in vivo. As ilhotas suínas e SC-beta produziram insulina em modelos de xenotransplante, e as ilhotas de camundongos testadas em um modelo de transplante singênico de massa marginal curaram o diabetes em 92% dos receptores dentro de 24 a 48 horas após o transplante. Excelente controle glicêmico foi observado por 150 dias. Por fim, nossa abordagem processou 2.500 ilhotas com > 95% de recuperação de ilhotas em > 89% de viabilidade pós-descongelamento e pode ser facilmente ampliada para maior rendimento. Esses resultados sugerem que a criopreservação agora pode ser usada para suprir as ilhotas necessárias para melhorar os resultados do transplante que curam o diabetes.

Apesar de 100 anos de desenvolvimento terapêutico desde a descoberta da insulina, as terapias atuais para diabetes, como monitores contínuos de glicose, bombas de insulina e sistemas de circuito fechado, continuam sendo um tratamento para a condição e não uma cura para a doença1. Embora nas últimas décadas tenha havido um progresso substancial no desenvolvimento do transplante de ilhotas como uma cura potencial para o diabetes2, uma das principais limitações dessa abordagem é que os transplantes de um único doador geralmente são insuficientes para alcançar a independência da insulina no receptor3,4. Frequentemente, duas, três ou mais infusões de ilhotas de doadores totalizando 700.000 a >1 M de equivalentes de ilhotas (IEQs) são necessárias para um receptor 'típico' de 70 kg5,6, adicionando riscos associados a intervenções cirúrgicas repetidas e várias rodadas de forte indução de imunossupressão.

Uma estratégia para superar o problema de suprimento de doadores é agrupar ilhotas de vários doadores, alcançando alta dosagem de ilhotas com uma única infusão7,8, aumentando a eficácia e reduzindo o risco. Embora vários grupos tenham mostrado a viabilidade de cultivar ilhotas por períodos prolongados (semanas a meses)9, a maioria relatou redução da recuperação das ilhotas e perda da função endócrina ao longo do tempo10,11. Assim, grandes ensaios clínicos geralmente limitam a cultura a 48–72 horas antes do transplante12. Essa incapacidade de cultivar ou armazenar ilhotas de alta qualidade por mais de alguns dias após o isolamento, no entanto, torna o agrupamento de ilhotas logisticamente impraticável. Uma segunda estratégia é desenvolver uma fonte alternativa de ilhotas, como ilhotas derivadas de SC, que oferecem a empolgante promessa de um suprimento ilimitado de ilhotas13,14 e menor dependência da disponibilidade limitada de doadores. As ilhotas derivadas de SC produzem insulina em resposta à glicose, restauram a normoglicemia em alguns modelos de transplante animal e foram testadas em estudos de fase 1 e 2 em humanos. No entanto, a heterogeneidade na composição das células endócrinas e a variabilidade na função13 levam a uma variabilidade considerável de lote para lote15, exigindo extensa validação pré-transplante de cada lote, durante o qual as ilhotas SC se deterioram na cultura. A incapacidade de armazenar ilhotas antes do uso é um desafio comum em ambas as estratégias. O armazenamento de longo prazo é necessário para superar as barreiras da cadeia de abastecimento que limitam a disponibilidade de quantidades suficientes de ilhotas e para permitir uma avaliação de qualidade adequada antes do transplante.

4 M) can lower the required CCR and CWR to attainable levels but cause toxicity in cells and tissues, especially at higher temperatures (>4 °C). Thus, there is a critical balance point that avoids both injury from ice and from CPA toxicity while maintaining clinical scalability. Previous islet vitrification strategies were limited to small volumes with low islet quantities (<150 islets in microliter volumes of CPA solution; Supplementary Table 1) to ensure sufficient cooling and warming rates, and volumetric scale-up reduced the cooling and warming rates and led to ice formation, compromising viability. To our knowledge, no published technique has simultaneously achieved islet cryopreservation with high viability, function and recovery in a clinically scalable protocol (Supplementary Table 1)./p>95% of the volume on the cryomesh, whereas 20 islets in a 2-µl droplet occupy only 1.8% of the total volume. Supplementary Table 2 summarizes the performance of cryomesh, droplet and cryotop VR approaches, emphasizing both the improved cooling and warming rates and the ability to scale-up the cryomesh./p>300,000 islets per batch (typical yields for single-donor isolation are <300,000 IEQs5); and adaptation to clinical-grade processing (details in Supplementary Results and Discussion). We believe each of these limitations will be readily overcome in future development./p>

400 mg dl−1. Marginal mass islet transplants of 250 islets per recipient51 were performed under the recipient mouse's left kidney capsule. For all treatment groups, islets were randomly selected for transplantation, including islets of all sizes, both morphologically disrupted and intact islets. BG measurements were made daily. Transplant success was measured on the first day of two successive daily measurements of BG < 200 mg dl−1. Graft failure was defined as the first day of two consecutive measurements >250 mg dl−1./p>