Recuperação paralela da acessibilidade da cromatina e dinâmica da expressão gênica de células T reguladoras humanas congeladas

Scientific Reports volume 13, Número do artigo: 5506 (2023) Citar este artigo

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Recursos epigenéticos, como a acessibilidade do DNA, ditam a regulação transcricional de maneira específica do tipo e do estado da célula, e mapear isso em saúde versus doença em material clinicamente relevante está abrindo a porta para novos insights mecanicistas e novos alvos para terapia. O Ensaio para Sequenciamento de Cromatina Acessível por Transposase (ATAC-seq) permite o perfil de acessibilidade de cromatina a partir de baixa entrada de células, tornando-o tratável em populações de células raras, como células T reguladoras (Treg). No entanto, pouco se sabe sobre a compatibilidade do ensaio com populações de células raras criopreservadas. Aqui demonstramos a robustez de um protocolo ATAC-seq comparando células Treg primárias recuperadas de amostras de PBMC frescas ou criopreservadas, no estado estacionário e em resposta à estimulação. Nós estendemos este método para explorar a viabilidade de realizar quantificação simultânea de acessibilidade da cromatina e transcriptoma de uma única alíquota de 50.000 células Treg criopreservadas. O perfil de acessibilidade da cromatina e expressão gênica em paralelo dentro do mesmo pool de células controla a heterogeneidade celular e é particularmente benéfico quando limitado por material de entrada limitado. No geral, observamos uma alta correlação de padrões de acessibilidade e dinâmica de fatores de transcrição entre amostras frescas e criopreservadas. Além disso, perfis transcriptômicos altamente semelhantes foram obtidos a partir de células inteiras e dos sobrenadantes recuperados das reações ATAC-seq. Destacamos a viabilidade de aplicar essas técnicas para traçar o perfil da paisagem epigenômica de células recuperadas de biorrepositórios de criopreservação.

A expressão gênica é regulada pela ligação de fatores de transcrição (TFs) aos promotores proximais e elementos reguladores distais, como intensificadores. A estrutura da cromatina tem uma grande influência na expressão gênica, controlando o acesso dos TFs aos sítios de ligação nesses intensificadores e promotores1. Padrões localizados de modificação epigenética da cromatina, como modificação de histonas, metilação do DNA e remodelamento do nucleossomo, correlacionam-se com atividade intensificadora, ligação de TF e regulação da transcrição. A acessibilidade da cromatina refere-se ao grau em que as proteínas são capazes de interagir fisicamente com a cromatina e é fortemente influenciada por modificações epigenéticas, posicionamento do nucleossomo e proteínas de ligação à cromatina que restringem o acesso ao DNA2. A cromatina mais acessível ou aberta está associada a regiões transcricionais ativas e elementos reguladores, enquanto a cromatina fechada está associada a regiões silenciosas ou reprimidas. Por exemplo, embora o DNA acessível represente ~ 2–3% do genoma, ele captura mais de 90% das regiões ocupadas pelos TFs analisados ​​no projeto ENCODE2,3,4. A acessibilidade da cromatina é geralmente determinada experimentalmente pela suscetibilidade da cromatina à metilação ou clivagem enzimática. No entanto, os métodos convencionais de perfil de cromatina, como DNase-seq, requerem milhões de células como requisito de entrada e envolvem um fluxo de trabalho de preparação de biblioteca complexo. Ensaio de cromatina acessível por transposase com sequenciamento de alto rendimento (ATAC-seq) é uma abordagem relativamente nova em todo o genoma que sonda simultaneamente a estrutura da cromatina (acessibilidade e posicionamento do nucleossomo) e, principalmente, ligação de TF em alta resolução com menor necessidade de entrada do que outras técnicas5,6 . O desenvolvimento do ATAC-seq tornou possível quantificar a acessibilidade da cromatina usando um número muito menor de células, tornando-o, portanto, passível de ambiente clínico e populações de células raras de interesse. A medição da acessibilidade da cromatina na resolução de célula única também se tornou possível com o desenvolvimento de estratégias de sequenciamento ATAC de célula única (scATAC-seq)7,8,9. No ATAC-seq, a transposase Tn5, pré-carregada com adaptadores de sequenciamento de última geração, corta e liga simultaneamente os adaptadores de sequenciamento em regiões acessíveis de cromatina aberta5,6. Os fragmentos capturados entre os adaptadores podem então ser amplificados por PCR e submetidos a sequenciamento de alto rendimento5,6.