Luz 3D eficiente

Biologia da Comunicação volume 6, Número do artigo: 170 (2023) Citar este artigo

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Detalhes das métricas

A capacidade de gerar imagens de amostras de tecido humano em 3D, com resolução celular e um grande campo de visão (FOV), pode melhorar as investigações fundamentais e clínicas. Aqui, demonstramos a viabilidade de imagens de folhas de luz de ~ 5 cm3 de cérebro humano fixado em formalina e até ~ 7 cm3 de amostras de câncer de próstata fixadas em parafina (FFPE), processadas com o protocolo FFPE-MASH. Apresentamos um protótipo de microscopia de folha de luz, o Microscópio de Iluminação de Plano Seletivo de visualização dupla de tecido limpo (ct-dSPIM), capaz de aquisições rápidas de alta resolução em 3D de tecido limpo em escala de cm3. Usamos varreduras de mosaico para rápidas visões gerais em 3D de amostras inteiras de tecido ou visões gerais de alta resolução de grandes ROIs com várias velocidades: (a) Mosaico 16 (resolução isotrópica de 16,4 µm, ~1,7 h/cm3), (b) Mosaico 4 (4,1 µm isotrópico resolução, ~ 5 h/cm3) e (c) Mosaico 0,5 (0,5 µm próximo à resolução isotrópica, ~15,8 h/cm3). Podemos visualizar camadas corticais e neurônios ao redor da borda das áreas V1 e V2 do cérebro humano e demonstrar uma qualidade de imagem adequada para a classificação do escore de Gleason em amostras espessas de câncer de próstata. Mostramos que a imagem ct-dSPIM é uma excelente técnica para avaliar quantitativamente amostras de tecido humano em grande escala preparadas para MASH em 3D, com potencial clínico futuro considerável.

Apesar das claras vantagens das visualizações de microestrutura em grande escala, as amostras de tecido em pesquisa fundamental e patologia clínica ainda são examinadas principalmente com microscópios de luz convencionais em seções de tecido finas como papel (variando de aprox. 5–100 µm), montadas em lâminas de vidro. Isso destrói a estrutura do órgão 3D e fornece apenas informações 2D limitadas em um pequeno campo de visão (FoV). Portanto, avanços significativos são necessários para novas abordagens de microscopia multiescala 3D de alta velocidade e alto volume com resolução suficiente. Isso permitirá a detecção de detalhes cruciais e características gerais em todas as grandes amostras de tecido (variando de mm a cm de tamanho).

A complexa estrutura 3D do cérebro humano é inerentemente multiescalar e existe em estruturas muito pequenas que se estendem por grandes distâncias, até mesmo áreas inteiras do cérebro1. A citoarquitetura cortical em camadas, por exemplo, é definida pela densidade, tamanho e morfologia celular na escala microscópica, mas suas camadas se estendem por áreas corticais inteiras e, portanto, as camadas ocorrem em escalas de centímetros. Para permitir a caracterização quantitativa, como a contagem de células, em várias camadas e até mesmo em áreas inteiras do cérebro, é necessário realizar grandes varreduras gerais de FoV, bem como imagens celulares de alta resolução. Este tipo de dados é essencial para, por exemplo, modelagem neural biologicamente informada realista2. Portanto, a investigação da citoarquitetura em camadas requer imagens de alta resolução e grandes FoVs.

No câncer de próstata, os tumores são caracterizados por multifocalidade e morfologia heterogênea com diversos padrões histomorfológicos em 3D, ao longo de volumes extensos3,4. Até o momento, um diagnóstico definitivo de câncer de próstata requer verificação histopatológica de biópsias com base na classificação de Gleason Score3. Isso é desafiador, conforme demonstrado pela variabilidade interobservador, que por sua vez pode levar ao sub ou supertratamento dos pacientes4. Além disso, os critérios para "vigilância ativa" são determinados pela quantificação da extensão do tumor e grau de Gleason5. Como raramente são feitos cortes seriados completos de núcleos de biópsia de próstata, uma subclassificação pode ocorrer em casos com múltiplos pequenos focos de adenocarcinoma de próstata, porque eles estão presentes em níveis diferentes nos blocos de parafina5. Além disso, biópsias falso-negativas podem ocorrer a partir do corte incompleto de blocos de tecido. Por exemplo, Paulk et al. demonstram a ocorrência de carcinoma de próstata nos cortes mais profundos dos blocos de parafina que estava ausente nos cortes iniciais de H&E5. Na prática atual, o corte rotineiro de todos os blocos de parafina para aumentar a visualização do tecido pode não ser possível devido à maior carga de trabalho e ao preço mais alto, em comparação com o procedimento padrão de seccionamento de apenas 3 a 4 níveis.